.png "English"){kind=small}
Kultur Jaringan TANAMAN KENTANG
( Solanum tuberosum l )
Penanaman eksplan harus dilakukan pada ruangan yang harus
steril, dan eksplan juga dalam keadaan yang steril pula. Penanaman dapat
dilakukan pada ruangan tertutup atau ruangan penabur dalam Laminar Air
Flow (LAF).Ruangan digunakan, setelah dilakukan sterilisasi dengan menggunakan
larutan alkohol 96 % pada lantai dan dinding ruangan, dan membiarkan ruangan
selama 30 menit dengan sinar UV yang menyala.Kontaminasi yang terjadi pada
kultur jaringan merupakan momok yang cukup mengganggu proses kultur jaringan.
Namun kontaminasi juga dapat dicegah dengan perlakuan-perlakuan yang aseptic.
Stelah dua acara praktikum diatas dilakukan sterilisasi
terhadap peralatan kultur dan media kultur,tanaman atau eksplan yang akan
ditanam juga harus dalam keadaan steril dan sehat artinya eksplan tidak
terserang penyakit ataupun terkena serangan mikroba.Keberadaan kontaminan yang
berasal dari spora maupun mikroba lainnya sangat sulit dihindari termasuk juga
di dalam ruang kultur. Untuk itu sterilisasi ruangan juga perlu dilakukan
tentunya dengan tujuan untuk menciptakan lingkungan yang aseptic dan
menghilangkan mikroba maupun spora penyebab kontaminan.
1. Penyiapan Ruangan
a. Sebelum digunakan ruang penabur disterilkan dengan sinar UV
selama 30 menit atau dengan menyemprotkan alcohol 96% ke bagian tangan dan
botol yang berisi media
b. Alat-alat yang digunakan diatur dengan rapi pada LAF, posisi
scalpel dan pinset serta alcohol 96% yang digunakan untuk mensterilkan
dissecting kit.
c. Petridish diletakan dibagian tengah, setiap selesai eksplant
dipotong petridish ditutup kembali untuk menghindari kontaminasi.
d. Selesai digunakan alat disterilkan dengan alkohok dan
dibakar dengan Bunsen
e. Sebelum masuk kedalam LAF semua seperti botol dan tangan
harus disterilkan dengan alcohol 96%.
f.
Setiap selesai menggunakan pinset
maupun scalpel, lalu dicelupkan kedalam alkohol, lalu dibakar pada nyala api
bunsen.
2. Penyiapan Eksplan
Eksplan
adalah bahan tanaman yang akan dikulturkan, dapat berupa daun, tunas, pucuk,
bunga, endosperm, buah muda, sel, protoplas dan yang lainnya.
3. Penanaman Eksplan
- Disiapkan alat-alat yang akan digunakan untuk penanaman eksplan.
- Diambil potongan eksplan yang sudah siap untuk ditanam dengan pinset.
- Dibuka botol kultur yang telah berisi media dan dibakar bagian mulut botol.
- Diletakan eksplan kedalam media dengan hati-hati.
- Botol ditutup dengan kertas aluminium foil dan diseal.
- Diletakan pada ruang inkubasi.
- Diamati perkembangan eksplan.
Kultur jaringan merupakan salah satu
teknik memperbanyak suatu tanaman dengan cara menanam sebagian kecil jaringan
pada medium yang sudah dalam keadaan steril.Dalam melakukan proses kultur
jaringan ada beberapa langkah yang harus dilakukan diantaranya adalah
menentukan tujuan yang ingin dicapai hal ini penting karena menyangkut materi
yang akan digunakan.Setelah mengetahui tujuan yang ingin dicapai langkah yang dilakukan
berikutnya adalah menentukan medium yang akan digunakan.
Proses kultur jaringan tidak bisa dilakukan di tempat yang
sembarangan, akan tetapi dilaksanakan pada laboratorium tertentu. Proses
penyimpanan eksplan dilakukan di dalam ruang penabur.Dimana ruang penabur
merupakan kunci keberhasilan budidaya in-vitro. Didalam ruangan ini semua
dilakukan dengan steril, dan pengawasan kesterilan di ruang penabur tersebut
sangat ketat. (MoesoS,1996)
LAF cabinet merupakan suatu kotak tempat sterilisasi dan penanaman
eksplan ( bahan tanam ). Di dalam laminar, terdapat blower dan lampu
ultra violet. Blower menghembuskan udara halus melalui suatu kotak filter yang
fungsi untuk mencegah kontaminan yang berasal dari udara. Sementara itu,
lampu ultra violet berfungsi untuk mematikan kontaminan yang berada di
permukaan dalam laminar, permukaan dalam laminar dilap dengan kapas atau tissu
yang sebelumnya dicelupkan dalam alkohol 70% dan lampu ultra violetnya
dinyalakan selama 0,5-1jam (Hendaryono,1994).
LAMINAR AIR FLOW CABINET
Prinsip kerja Laminar Air Flow Cabinet
1) Lamianar Air Flow Cabinet digunakan sebagai meja kerja
steril untuk kegiatan inokulasi/ penanaman.
2) Laminar Air Flow Cabinet mengutamakan adanya hembusan udara
steril yang digerakkan oleh blower yang disaring oleh HEPA Filter.
3) Sebelum dioperasikan Laminar Air Flow Cabinet harus
dinyalakan minimal 30 menit dan harus dilakukan penyemprotan dengan alcohol
agar alat dan ruang kerja tersebut terjamin kesterilannya.
4) Pada saat melaksanakan pekerjaan, harus dinyalakan blowernya
yang berfungsi sebagai penghembus udara steril dan lampu TL sebagai penerang.
5) Agar Laminar Air Flow Cabinet dapat difungsikan setiap
saat,pemeliharaan dan perawatan alat harus selalu dilakukan.
Cara kerja Laminar Air Flow Cabinet.
1)
Bersihkan meja kerja dengan menggunakan
tissue, Semprot meja kerja dengan menggunakan alkohol tanpa mengenai bagian
filter HEPA.
2)
Tutup kaca Laminar Air Flow Cabinet,
kemudian nyalakan lampu UV selama 30 menit.
3)
Setelah minimum 30 menit, matikan lampu
UV dan buka kaca laminar air flow cabinet serta nyalakan lampu TL dan blower.
4)
Siapkan pisau scalpel dan pinset pada
meja kerja steril Semprotkan alat tersebut dengan menggunakan alcohol.
5)
Bakarlah alat tersebut dengan
menggunakan nyala api lampu spirtus. Lakukan kegiatan inokulasi dengan
hati-hati dan cermat sesuai dengan petunjuk kerja.
6)
Bersihkan kembali Laminar air flow
cabinet sehingga dalam kondis siap pakai.Matikan blower dan lampu TL,tutup
kembali pintu kaca meja steril.
Pada laminar air flow cabinet, terdapat 2 macam filter :
- Pre-filter, yang menggunakan saringan pertama terhadap debu-debu dan benda-benda yang kasar. Pori-porinya kira-kira 5mm sehingga efisiensinya dapat mencapai 95mm untuk objek-objek yang >5mm.
- HEPA filter dengan pori-pori 0.3 m dan terdapat pada bidang keluar udara kearah permukaan tempat kerja.
Pre-filter
harus sering dibersihkan dengan vacum cleaner dan sebaiknya diganti 1 tahun
sekali. Namun HEPA filter diganti setelah melalui pemeriksaan dengan
particulate count atau dengan alat yang disebut magnehelic gauge. Laminar air
flow cabinet ada yang dilengkapi dengan lampu UV, ada juga yang tidak. Pada
laminar air flow cabinet yang tidak dilengkapi dengan lampu UV, blower harus
dijalankan terus menerus walaupun laminar air flow cabinet tersebut sedang
tidak dipergunakan. Hal ini dilakukan untuk menjaga kebersihan ruang kerja
didalam laminar air flow tersebut. Pada laminar air flow yang dilengkapi dengan
lampu UV. dianjurkan agar menyalakan lampu UV. minimum 30 menit sebelum laminar
air flow digunakan. Ketika laminar air flow sedang digunakan, lampu UV harus
dimatikan, sedangkan blower dijalankan. Blower pada laminar air flow cabinet
yang dilengkapi dengan lampu UV, hanya dijalankan pada saat laminar air flow
sedang digunakan. ( D.F.Wetherell,1976 )
Komponen dan bahan.
ü Sentrifugal Blower 90 watt, dengan setting dua kekuatan.
ü Lampu Ultra violet 15 watt, panjang gelombang < 320
nanometer (khusus untuk sterilisasi).
ü Bahan pelapis luar dan ruang kerja bagian dalam adalah plat
Almunium.
ü Komponen dasar Mulipel blok.
ü Lapisan bagian dalam diberi lapisan peredam suara, sehingga
suara mesin sangat halus. lantai kerja almunium dilapis kaca tebal 5 mm di cat
bagian bawahnya putih.
ü Rangka luar filter Kawat persegi aluminium versi baru.
ü Komponen penutup ruang kerja adalah akrilik kualitas
prima/bening.
ü Bagian dalam dilengkapi lapisan kaca setengah bagian untuk
mengurangi kontaminasi dari luar.
ü Dilengkapi dengan rangka meja besi yang kokoh khusus untuk
meletakkan LAFC.
Sterilisasi
Eksplan
Sterilisasi eksplan dapat dilakukan atau dilaksanakan dengan
dua cara yaitu secara mekanik dan secara kimia.
a. Sterilisasi eksplan secara mekanis.
Cara ini digunakan untuk eksaplan yang keras atau berdaging,
yaitu dengan membakar eksplan tersebut diatas lampu spirtus sebanyak tiga kali.
Eksplan keras yang disterilkan dengan cara ini adalah tebu, biki salak, bung,
buah anggrek, akapulaga dan sebagainya.
b. Sterilisasi eksplan dengan cara kimiawi.
Sterilisasi secara kimiawi digunakan untuk eksplan yang
lunak seperti daun, tangkai daun, dan sebagainya.
Bahan kimia yang sering dipakai untuk disinfestasi adalah
alkohol seperti etil, metil, atau isopropyl-alkohol dengan konsentrasi 70-80%,
Ca-hipoklorit atau Na- hipoklorit.
Macam-macam bahan untuk sterilisasi dan
fungsinya:
1. Deterjen (Membershkan kotora/debu dari eksplan)
2. Fungisida (Memberihkan jamur/cendawan)
3. Bakterisida (Membersihkan bakteri)
4. Alkohol 70% dan 95%
5. Sodium hipoklorik dengan nama dagang clorox atau bayclin.
6. Mercury chlorit dengan nama dagang sublima 0,05 %
7. Tween -20 (Agen pembasah)
8. Antibiotik.
9. Iodine/betadine Antiseptik.
Satu hal yang penting dalam sterilisasi permukaan eksplan
adalah mengkompromikan antara usaha untuk mendapatkan eksplan yang steril dan
menjaga agar jaringan eksplan tidak rusak akibat tingginya konsentrasi
disinfektan. Untuk meminimalkan tingkat
kontaminasi dan mendapatkan pertumbuhan eksplan yang cepat, beberapa perlakuan
(threatment) terhadap tanaman induk sumber eksplan dapat diterapkan sebagai
berikut:
·
Pemeliharaan tanaman induk di rumah
kaca dengan pengendalian hama dan penyakit tanaman secra intensif.
·
Pemangkasan tanaman induk diikuti
pemupukan yang seimbang. Flush atau trubusan baru yang tumbuh setelah
pemangkasan digunakan sebagai eksplan. Flush yang tumbuh tersebut sebaiknya
disemrot dengan fungisida sistemik ( Benlate) dan bakterisida ( Agrept) agar
tumbuhnya lebih sehat.
·
Perlakuan tanaman induk dengan
temperatur yang tertentu seperti suhu rendah (4oC) atau suhu tinggi (35oC).
·
Perlakuan tanaman induk dengan ZPT
seperti sitokonin atau giberelin. Sitokonin untuk merangsang tumbuhnya
tunas-tunas aksilar, sedangkan giberelin untuk merangsang pemanjangan tunas.
Pemeliharaan tanaman induk dalam
keadaan yang lebih higienis yaitu dengan menumbuhkannya di dalam rumah kaca
dengan pengendalian hama dan penyakit tanaman yang intensif membuktikan dapat
mengurangi tingkat kontaminasi eksplan yang diambil dari tanaman tersebut,
terutama yang disebabkan oleh cendawan. Namun, cara ini sulit diterapkan untuk
kontaminasi yang disebabkan oleh mikroorganisme endofilik, terutama bakteri.
Eksplan atau kultur dapat terkontaminasi oleh berbagai
mikrooganisme seperti jamur, bakteri, serangga atau virus. Namun, sumber utama
kontaminan adalah spora jamur dan bakteri yang membentuk bagian alami dari
atmosfer. Banyak yang bersifat non-patogenik, artinya mereka tidak menyebabkan
bahaya bagi tanaman inang pada kondisi normal. Kontaminasi permukaan dapat
diatasi dengan cara pencucian menggunakan berbagai perlakuan bahan kimia.
Keterbatasan utama adalah untuk memberikan perlakuan yang cukup kuat untuk mengeliminasi
kontaminasi tanpa merusak jaringan tanaman. Ini biasanya dicapai dengan
menambahkan detergen, agitasi (digoyang –goyang), atau membenamkan eksplan
dengan sedikit tekanan untuk mengilangkan gelembung udara yang mungkin
mengandung mikroorganisme (Hendaryono,
1994).
Kontaminasi
yang disebabkan oleh mikroorganisme endofilik (organisme yang hidup di dalam
sel atau ruang antar sel tanaman) yang sering merupakan biote dari tanaman
sumber eksplan, sulit diatasi dengan sterilisasi permukaan. Keadaan ini
disebabkan oleh koloni baktri sering tidak muncul pada saat eksplan baru
dikulturkan pertama kali, tetapi beberapa minggu kemudian muncul koloni
bakteri. Bakteri tersebut tetap ada setelah disubkulturkan berkali-kali, karena
hidupnya memang secara epifit di dalam jaringan tanaman.
Eksudasi dari eksplan merupakan tipe kontaminasi yang
lain, bukan dari organisme lain. Ketika jaringan tanaman terluka, dengan cara
pemotongan atau perlakuan bahan kimia seperti larutan klorin, reaksi fisiologis
terjadi pada sel sekitar luka. Salah satu prosesnya adalah produksi bahan
biokimia apakah sebagai produk pecahan atau sintesa sebagai mekanisme
perlindungan. Keluarnya substansi dari jaringan akan terjadi. Bahan kimia ini
mungkin atau mungkin tidak memberi pengaruh mematikan pada pertumbuhan kultur (Imron, 2007).
Eksplan yang baik
Eksplan sendiri adalah bagian tanaman
yang dipakai untuk bahan budidaya atau kultur jaringan
Eksplan yang baik adalah sebagai berikut :
a. Bagian tanaman yang masih muda
b. Diambil dari tanaman yang tumbuh subur dan sehat
c. Dinding sel amsih tipis dan belum berpembuluh kayu
d. Bersifat merismatik atau meristemoid.
Sterilisasi sangat penting karena :
a. Jasad renik yang terbawa eksplan akan tumbuh menutupi
eksplan dan media sehingga dapat menghancurkan jaringan yang akan ditanam.
b. Adanya jasad renik akan mengubah lingkungan karena hilangnya
zat makanan di media dan dilepaskan produk metabolit tambahan ke dalam media
dan dilepaskannya produk metabolit tambahan ke dalam media, sehingga dapat
menghancurkan eksplan yang akan ditanam.
.
.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam kegiatan
inisiasi/penanaman yakni sebagai berikut :
( Hawaauriz, 2009 ).
1. Alat dan bahan yang dimasukkan dalam laminar harus dipastikan dalam
keadaan steril sehingga perlu dilakukan penyemprotan dengan alkohol 70 %.
2. Untuk mengurangi masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan, sebelum
membuka tabung kultur sebaiknya mulut tabung digarang pada api terlebih dahulu
3. Kegiatan penanaman diusahakan dilakukan dengan cepat, karena semakin
cepat dilakukan penanaman maka eksplan tidak akan terlalu lama berikatan dengan
oksigen sehingga kemungkinan untuk browning semakin kecil.
Sebagai
sumber utama kontaminan, eksplan memiliki perlakuan khusus pada proses
sterilisasinya. Diantranya adalah pencucian dengan menggunakan deterjen
ditujukan untuk menghilangkan sisia-sisa tanah pada umbi eksplan. Selanjutnya
di rendam dalah alcohol untuk menghilangkan atau membunuh kuman. Selanjutnya
dicelupkan pada larutan klorok untuk membunuh mikroba terutama yang ada di
bagian dalam eksplan. Digunakan pula fungisida untuk membunuh spora ataupun
cendawan yang diperkirakan ada pada eksplan.
Setelah
dilkukan penanaman, eksplan tersebut diamati selama kurang lebih 2 minggu,
untuk mengetahui apakah terjadi kontaminasi pada eksplan ataupun media.
Adapun
kontaminasi yang sering terjadi pada kultur jaringan tanaman terdiri atas dua
jenis yaitu kontamiasi oleh bakteri dan kontaminasi oleh jamur. Untuk
membedakan kedua jenis kontaminasi ini, dapat dilihat dari ciri-ciri fisik yang
muncul pada eksplan maupun media kultur. Bila terkena kontaminasi bakteri maka
tanaman akan basah atau menyebabkan adanya lendir, hal ini dikarenakan bakteri
langsung menyerang terhadap jaringan dari tubuh tumbuhan itu sendiri. Sedangkan
bila terkontaminasi oleh jamur, tanaman akan lebih kering dan akan muncul hifa
jamur pada tanaman yang terserang dan biasanya dapat dicirikan dengan adanya
garis – garis (seperti benang) yang berwarna putih sampai abu – abu. Penyebab
terjadinya kontaminasi bisa diakibatkan karena kesalahan pada saat penanaman,
saat sterilisasi media dan eksplan atau bahkan pada saat pembuatan media.
Berdasarkan
pengamatan dilakukan selama 2 minggu (3 kali pengamatan) ternyata ketiga
eksplan terkontaminasi. Adapun pada pengamatan pertama (2 hari setelah
penanaman) kondisi eksplan dan media tumbuh kultur masih dalam keadaan baik.
Sedangkan pada pengamatan kedua, eksplan dan media kultur telah terkontaminasi
oleh jamur. Hal ini ditunjukkan dengan adanya kontaminan yang berwarna putih
dan membentuk seperti benang (hifa). Begitupun pada pengamatan selanjutnya,
kontaminasi yang terjadi oleh jamur makin jelas dan terlihat begitu nyata karena
hampir seluruh bagian permukaan eksplan dan media kultur ditumbuhi oleh jamur.
Kontaminasi bisa terjadi dikarenakan adanya kesalahan atupun kurang optimalnya
dalam penanaman maupun melakukan hal lain yang dapat mendukung keberhasilan
kultur jaringan tersebut, terutama dalam hal sterilisasi.[1]
CONTOH KULTUR JARINGAN KENTANG
Facebook
0 comments:
Post a Comment